内蒙古免疫共沉淀CoIP-mass spectrometry

CoIP实验细胞的收集及裂解方法：

收集2E7个细胞样品，加入PBS洗涤细胞，离心后弃上清收集细胞沉淀。

准备500μl预冷的CellLysisBuffer,分别加入5μlProteaseInhibitor、5μlPMSF，混匀后加进细胞沉淀中吹打均匀，冰上孵育30min，期间涡旋混匀几次。

4℃,12000rpm离心10min，取上清，进行蛋白浓度测定及后续实验。

CoIP实验免疫复合物的制备：

在离心管中，将每个样品的细胞裂解液与2-10μg免疫沉淀抗体结合。每个免疫沉淀反应推荐的总蛋白量为500-1000μg，由PierceBCAProteinAssay蛋白浓度检测试剂盒测定。

用免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液将抗体/裂解液稀释至500μL。

在室温下孵育1-2h，或4℃过夜，以形成免疫复合物。 Co-IP高特异灵敏，适用多样本，兼容质谱，操作简便，优势大！内蒙古免疫共沉淀CoIP-mass spectrometry

Co-IP（免疫共沉淀）实验注意事项主要包括。抗体选择：选择特异性强的抗体至关重要，以确保与目标蛋白的准确结合，减少非特异性干扰。样品准备：样品的纯度和质量对实验结果有重要影响，因此要确保样品的制备过程规范，避免杂质干扰。实验条件：在操作过程中，要注意合适的实验条件，如温度、pH值等，以保证实验的顺利进行和结果的稳定性。洗涤步骤：洗涤步骤是去除非特异性结合的关键，要确保洗涤充分，去除杂质，同时避免目标蛋白的丢失。抗体浓度：抗体浓度也是影响实验结果的重要因素，要根据实验需要选择合适的抗体浓度。阴性对照：设置阴性对照对于判断结果的可靠性至关重要，要确保阴性对照无明显结合。遵循以上注意事项，可以提高Co-IP实验的准确性和可靠性，为后续研究提供有力支持。内蒙古免疫共沉淀CoIP-mass spectrometry免疫共沉淀实验步骤主要包括几个部分。

免疫共沉淀又叫Co-IP，是利用抗原A与蛋白B结合，通过A的抗体沉淀A，再利用精制的prorein A/G预先结合到磁珠上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，磁珠上的prorein A/G就能吸附抗原，从而获得抗原A与蛋白B的复合体，之后就可以对B进行检测，从而获得蛋白质与蛋白质相互作用的信息。

免疫共沉淀的优点

相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物；（4）能够对间接相互作用的蛋白进行捕获，比如对蛋白复合物的多种成分进行鉴定；（5）可以研究具有修饰的目的蛋白；（6）操作流程较为简便，不需要事先制备大规模蛋白表达文库。

免疫共沉淀CoIP实验，细胞的收集及裂解方法如下：

收集2E7个细胞样品，加入PBS洗涤细胞，离心后弃上清收集细胞沉淀。

准备500μl预冷的CellLysisBuffer,分别加入5μlProteaseInhibitor、5μlPMSF，混匀后加进细胞沉淀中吹打均匀，冰上孵育30min，期间涡旋混匀几次。

4℃,12000rpm离心10min，取上清，进行蛋白浓度测定及后续实验。广州基云生物，在IP互作组检测和关键机制分子筛选验证领域，具有丰富的经验，助力您的互作机制研究，欢迎垂询合作。 Co-IP实验要点：温和裂解、验证抗体、充分结合、沉降分离、洗脱纯化，确保结果准确可靠！

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到富集的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。免疫共沉淀法特异性强、可控性高，可用于研究蛋白互作，反映天然状态，可逆且操作简便。内蒙古免疫共沉淀CoIP-mass spectrometry

Co-IP技术助力蛋白互作与泛素化研究，揭示生命过程奥秘！内蒙古免疫共沉淀CoIP-mass spectrometry

CoIP实验Western检测目的蛋白方法如下：

配胶。

上样，跑电泳，恒压100min。

转膜，湿转250mA恒流转1-2h。

封闭，将PVDF膜放入5%的脱脂牛奶中，封闭1h。

孵育一抗（PBS稀释），4℃孵育过夜。

TBST洗膜3次，每次5min。

孵育二抗（TBST稀释），室温孵育1h。

TBST洗膜3次，每次5min。

按1：1的比例将ECL发光液均匀滴到膜上

曝光，显影，定影。

广州基云生物，在IP互作组检测和关键机制分子筛选验证领域，具有丰富的经验和专业的技术，助力您的互作机制研究。 内蒙古免疫共沉淀CoIP-mass spectrometry